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AIFA: “Taglia e incolla molecolare”, dall’ editing genetico nuove speranze di cura?

di Saverio Vasta e Luca Pani

Gli ultimi sviluppi vengono dall'anemia falciforme

Quando, 14 anni fa, fu annunciato al mondo il sequenziamento dell’intero genoma umano, enormi aspettative furono riposte nelle potenziali applicazioni in medicina delle nuove conoscenze, e in particolare nel possibile incremento delle capacità predittive, diagnostiche e terapeutiche della genetica medica.

Nonostante qualche previsione forse affrettata e comunque eccessivamente ottimistica e alcuni passi falsi, gli studi recenti sembrano promettere una svolta nell’approccio a diverse patologie. Nella maggior parte dei casi, questi studi stanno affrontando le prime fasi della sperimentazione, ma nel 2015, per molti di loro, si prevedono i primi test sull’uomo. Negli ultimi 30 anni1 in tutto il mondo sono stati approvati 1992 studi clinici di terapia genica, quasi due terzi (63,9%) negli Stati Uniti e un quarto (25,8%) in Europa.

Solo una manciata ha raggiunto finora la fase III. E l’unico prodotto di terapia genica approvato nel mondo occidentale è attualmente il Glybera (alipogene tiparvovec), indicato per pazienti adulti con diagnosi di deficit familiare di lipasi lipoproteica (Lipoprotein lipase deficiency, LPLD) e con gravi o ripetuti attacchi di pancreatite nonostante la dieta a ridotto contenuto di grassi. L’approvazione del Glybera in UE ha rappresentato una pietra miliare per i farmaci a base genetica e ha costituito per le aziende farmaceutiche un significativo impulso a investire in un settore da sempre considerato rischioso, per via delle risorse richieste, del continuo alternarsi di successi e fallimenti e del target terapeutico per questo tipo di farmaci che spesso è rappresentato da patologie rare.

 

Glybera è ormai pronto al lancio sui mercati europei. In Germania si attendono per aprile 2015 le valutazioni della Commissione federale congiunta. Il prezzo al pubblico richiesto dai produttori ammonterebbe a 53.000 euro per fiala, 1,1 milioni di euro per l’unico (in teoria) ciclo di trattamento. Cifre elevatissime, sebbene i pazienti che ne potranno beneficiare in Europa siano al momento qualche centinaio. L’impatto sui sistemi sanitari pubblici in questo caso potrebbe quindi essere contenuto, tuttavia le negoziazioni del prezzo negli Stati europei, così come le procedure di autorizzazione adottate nel caso specifico dalle autorità regolatorie (“progressive licensing”)2 , rappresentano un punto di riferimento per le future terapie geniche, come accaduto per il Sofosbuvir per le altre terapie per l’epatite C, anche se l’incidenza nettamente maggiore dell’infezione da HCV sulla popolazione ha avuto un impatto rilevante sulla contrattazione del prezzo.

Le sperimentazioni cliniche di terapia genica eseguite finora hanno per lo più riguardato le neoplasie, le malattie cardiovascolari e le malattie ereditarie monogeniche. La terapia genica promette invece di trovare applicazione anche nelle malattie infettive, infiammatorie, autoimmuni e neurodegenerative.

Quasi tutte le maggiori aziende farmaceutiche hanno annunciato l’avvio di sperimentazioni di terapia genica e forse i rimbalzi azionari di alcune di esse sul mercato Nasdaq negli ultimi 18 mesi riflettono il crescente interesse degli investitori nel settore.

Le principali tecniche adottate finora dai ricercatori sono l'inserimento nel DNA di un gene funzionante o la modifica di un gene difettoso già presente, per cui le patologie che hanno maggiore probabilità di cura sono quelle causate da una singola mutazione (e non sono poche). La correzione del gene può avvenire ex vivo, quando un gruppo di cellule malate viene estratto dal paziente e trattato in vitro prima di essere reinfuso, o in vivo, mediante correzioni effettuate utilizzando appositi vettori.

Una strategia che sembra promettente è l’editing mirato del genoma mediante nucleasi artificiali. Questo concetto fu introdotto nel 1990, quando vennero progettati enzimi artificiali che tagliano il DNA, noti come zinc fingers nucleases (ZFN). Le ZFN si legano a una specifica sezione di DNA e creano un’interruzione a entrambe le estremità (“taglia e incolla molecolare”). A quel punto può essere inserita una specifica sequenza di DNA prodotta in laboratorio. Le cellule leggeranno nuovamente la sequenza partendo, però, dalle basi complementari corrette, fornite dall'esterno, fino a ripristinare la versione sana e funzionante del gene.

 

L’anemia falciforme si è dimostrato un candidato ideale per la ricerca in questo campo3: è causata da una mutazione di un amminoacido in un sito specifico del gene della catena β dell’emoglobina. Il risultato è la produzione di proteine di emoglobina anomale che fanno curvare i globuli rossi dando loro la tipica forma di falce. Le cellule ricurve divengono appiccicose, aderiscono le une alle altre e bloccano i vasi sanguigni, impedendo il passaggio del sangue ossigenato.

 

La terapia genica è stata utilizzata con successo in alcuni pazienti con disturbi del sistema immunitario, e la malattia a cellule falciformi è tra i prossimi obiettivi dei ricercatori. Il più avanzato di questi progetti è ormai alle soglie della sperimentazione clinica, e altri ne seguiranno a breve. Gli approcci in fase di sviluppo per il trattamento dell’anemia falciforme sono di entrambi i tipi sopra descritti. La terapia genica convenzionale, detta anche “aggiunta del gene” e l’editing genetico. In entrambi gli approcci, il DNA modificato determina la formazione di una normale proteina funzionante.
    
Nell’anemia falciforme, le uniche cellule che necessitano di modifiche del DNA sono le staminali ematopoietiche che si trovano nel midollo osseo. Esse formano continuamente nuovi globuli rossi per rimpiazzare quelli persi. Secondo George Daley, direttore dello Stem Cell Transplantation Program presso il Boston Children’s Hospital nel Massachusetts, “riprogrammandone anche solo una piccola parte si creeranno globuli rossi perfettamente formati sufficienti per eliminare i sintomi della malattia."

Si tratta di approcci promettenti, anche se diverse questioni dovranno essere affrontate prima dell’applicazione nell’uomo: assicurarsi, ad esempio, che le terapie colpiscano con precisione i loro obiettivi e non provochino danni irreparabili alle cellule o introducano informazioni genetiche supplementari che potrebbero causare gravi effetti come il cancro.

L’aggiunta di geni sta per diventare la prima terapia genica testata negli esseri umani per l’anemia falciforme. Al Centro di ricerca di medicina rigenerativa e cellule staminali dell’Università della California, il medico molecolare Donald Kohn sta sviluppando protocolli per una sperimentazione clinica di questa tecnica, che dovrebbe iniziare l’arruolamento dei pazienti entro la fine dell’anno in corso.


I ricercatori preleveranno il midollo osseo dall'anca di pazienti con anemia falciforme e ne estrarranno le cellule staminali ematopoietiche. Utilizzando un vettore virale, inseriranno un nuovo gene dell'emoglobina funzionante nel DNA delle cellule; il vecchio gene, ancora presente, sarà silenziato poiché il nuovo prenderà il sopravvento. Le cellule modificate saranno poi re-infuse nel flusso sanguigno del paziente e migreranno nel midollo osseo, dove potranno fornire una fonte continua di globuli rossi sani.

Kohn sostiene che questo approccio ha il potenziale di curare l’anemia falciforme e con effetti collaterali nettamente inferiori rispetto al trapianto di midollo osseo. Ha testato la tecnica iniettando cellule staminali ematopoietiche umane modificate in topi e ha scoperto che 2 o 3 mesi più tardi le cellule falciformi erano del tutto scomparse. “Il fattore limitante nei topi – secondo Kohn – è che possono sostenere innesti umani solo per un certo lasso di tempo. Negli esseri umani, la correzione dovrebbe durare tutta la vita, almeno per 50-70 anni”.

 

Una delle sfide nel trattamento dell’anemia falciforme con la terapia genica è la necessità di estrarre il midollo osseo per recuperare cellule staminali ematopoietiche. Nella maggior parte delle altre malattie, ai pazienti possono essere somministrati farmaci che ne favoriscono il passaggio dal midollo al sangue, dove possono essere facilmente prelevate. Ma nei pazienti con anemia falciforme, tali farmaci possono scatenare una crisi falciforme, un episodio molto doloroso, durante il quale cellule danneggiate si assemblano e bloccano i vasi sanguigni; la crisi può essere accompagnata da anemia, dolore toracico, difficoltà respiratorie, trombosi della milza, del fegato e rischi di ictus. Pertanto i ricercatori devono prelevare il midollo osseo, un’operazione lenta e difficile, che tra l’altro limita il numero di cellule che possono essere raccolte in una volta. Secondo Kohn non è ancora certo se questo approccio fornirà un numero di cellule staminali ematopoietiche sufficiente per la riprogrammazione. E, come per le altre procedure di trapianto di midollo osseo, il paziente avrà ancora bisogno di sottoporsi a chemioterapia per uccidere le rimanenti cellule del midollo in modo da permettere a quelle geneticamente modificate di sopravvivere una volta reintrodotte nell’organismo.

Parallelamente a questo approccio, Kohn sta esplorando l'uso di ZFN per modificare i geni falciformi. Ha già dimostrato che circa il 7% delle cellule emopoietiche può essere riparato in coltura utilizzando questa tecnica e un vettore virale. Poiché le cellule riparate continuano a replicarsi, anche questa piccola percentuale potrebbe essere in grado produrre una quantità sufficiente di globuli rossi funzionanti.

Kohn afferma che i pazienti hanno mostrato miglioramenti importanti quando appena il 10-20% delle cellule del loro donatore sono state infuse con successo e hanno iniziato a produrre nuove cellule sane.
Il vantaggio dell’editing genico rispetto all’aggiunta di gene è che fornisce una correzione reale. Le ZFN sono però costose e difficili da programmare. Nel 2010, è stata sviluppata una proteina che modifica il gene chiamata TALEN (attivatore della nucleasi dell'effettore della trascrizione), che utilizza un meccanismo simile alle ZFN ma è più economica e più facile da lavorare. È stata subito adottata per l'utilizzo nell’anemia falciforme.

Presso il Salk Institute for Biological Studies, a La Jolla, in California, il biologo di cellule staminali Juan Carlos Izpisua Belmonte utilizza i TALEN con vettori virali chiamati HDAdV (vettori adenovirali dipendenti da helper) per correggere la mutazione falciforme. Invece di cellule staminali emopoietiche prelevate da midollo osseo, il team di Izpisua Belmonte raccoglie cellule facili da ottenere, come le cellule del sangue, della pelle o dell’adipe e le trasforma in cellule staminali pluripotenti indotte (iPS), che possono essere poi convertite in qualsiasi tipo di cellula.

I ricercatori correggono il difetto genetico dell'emoglobina in vitro utilizzando l’editing del gene, quindi differenziano le cellule iPS riparate nelle cellule staminali del sangue. A questo punto, le cellule riparate potrebbero semplicemente essere infuse nel sangue del paziente, dove si farebbero strada all’interno del midollo osseo e inizierebbero a produrre cellule ematopoietiche sane. Ma Izpisua Belmonte sta anche lavorando a una cura che possa agire all'interno dell’organismo del paziente. Il suo team sta combinando i TALEN con il vettore virale HDAdV, per aumentare il tasso di successo dell’editing genico, e sta progettando un piano per gestire il vettore ibrido direttamente nel midollo osseo. Sebbene ogni infusione possa correggere solo l'1% delle cellule, dieci nel corso di diversi mesi – un numero che Izpisua Belmonte e il suo collega Mo Li ritengono realizzabile in termini di tempo e di costi - potrebbero alleviare i sintomi dell’anemia falciforme. "A poco a poco, riusciremo a correggere la malattia in vivo" dice Izpisua Belmonte. Finora, questa tecnica a 'vettore ibrido' ha mostrato un’efficacia promettente in cellule staminali del sangue del cordone ombelicale.

 

I CRISPR (brevi ripetizioni palindromiche interspaziate regolarmente raggruppate)4 sono gli strumenti più recenti a disposizione della tecnica dell’editing genetico. Mentre ZFN e Talen utilizzano una proteina che si attacca a una sezione specifica di DNA, i CRISPR usano un “RNA guida”, molto più facile da programmare rispetto alle proteine Talen e ZFN, oltre ad essere meno costoso e più efficiente. I CRISPR, che consentono di eseguire più manipolazioni genetiche per volta, lavorano in combinazione con la nucleasi Cas9 (CRISPR-Cas9): il CRISPR si attacca al gene bersaglio, la nucleasi Cas9 taglia entrambi i filamenti del DNA, disattivando il gene. L'approccio ha meno di due anni, ma molti ricercatori lo stanno sviluppando contemporaneamente ad altre tecniche in vitro. Una recente sperimentazione è stata condotta con successo su topi da laboratorio adulti, per curare la tirosemia ereditaria di tipo I, una patologia epatica.

Ci sono ostacoli di sicurezza da superare prima che l’editing genico possa essere applicato negli esseri umani, soprattutto perché comporta una modifica permanente nel genoma. La questione più spinosa è l'attività off-target.    

Gang Bao, ingegnere biomedico presso il Georgia Institute of Technology di Atlanta, sta sviluppando strategie di editing genico per l’anemia falciforme prestando particolare attenzione alla sfida di limitare gli effetti off-target. Egli osserva che, se i tagli errati si verificano in un gene che causa il cancro, potrebbero potenzialmente innescare la crescita del tumore.

Anche un tasso di attività fuori bersaglio inferiore all'1% sarebbe in grado di produrre seri rischi per la salute. Perché la tecnologia possa andare avanti, i ricercatori hanno bisogno di comprendere meglio gli effetti off-target. Il team di Bao ha creato un software per prevedere dove potrebbero verificarsi gli effetti fuori bersaglio per le diverse tecniche di editing del gene. Il software prevede 114 siti off-target potenziali nell'intero genoma per il sistema CRISPR/Cas9, e gli esperimenti ne hanno confermato 15 dal sequenziamento del DNA tagliato.    

Il team di Izpisua Belmonte sta inoltre esaminando il tasso di mutazioni indesiderate causate da tecniche di editing del gene. Ha creato linee di cellule iPS e poi curato la metà delle cellule usando HDAdV e TALEN, ma ha lasciato immutata l'altra metà. Le cellule modificate non avevano più mutazioni rispetto a quelle non modificate, indicando che - in contrasto con le scoperte di Bao sui CRISPR - l'uso di TALEN non sembra rendere le cellule meno sicure. Anche se il test nell’uomo è ancora lontano, questi risultati rendono i ricercatori ottimisti sulle potenzialità dell’editing genico.

 

L'altra grande sfida per i ricercatori di terapia genica è garantire che le cellule staminali modificate sopravvivano e generino globuli rossi sani, dopo il loro reinserimento nel midollo osseo. Le cellule modificate spesso muoiono per via dello stress accumulato durante la terapia. I ricercatori potrebbero essere in grado di migliorare il tasso di sopravvivenza cellulare fornendo contemporaneamente altri tipi di cellule, ma anche la velocità di editing genico sembra essere importante: maggiore è la durata della coltivazione in vitro, minori sono le loro probabilità di sopravvivenza. Sulla base della ricerca condotta finora, Bao considera i CRISPR il metodo migliore per tagliare il DNA, ma anche il più a rischio di attività fuori bersaglio. I Talen sono meno efficaci dei CRISPR, ma sembra abbiano effetti off-target inferiori. Il tasso di attività fuori bersaglio varia a seconda del tipo di cellule e nucleasi utilizzate. Kohn ha confrontato ZFN, Talen e CRISPR e ha concluso che tutti e tre hanno un potenziale terapeutico per i pazienti con anemia falciforme. Adesso la sfida indirizzarle alla cellula bersaglio e riparare accuratamente il gene dopo l’interruzione.



Infine, perché la terapia genica per l’anemia falciforme diventi realtà, i dati devono essere ordinati su larga scala. Intervenire sui geni può produrre risultati straordinari o devastanti, e la differenza tra i due esiti spesso si trova in un solo acido nucleico di un singolo gene. Ciò pone enormi responsabilità su ogni ricercatore, ma il potenziale enorme della terapia genica giustifica una tale assunzione di responsabilità.

1) Dati forniti recentemente da The Journal of Gene Medicine
2) Un approccio adattivo, auspicato anche da molti pazienti e industrie del farmaco, che prevede fasi successive di raccolta di nuove evidenze, a cui segue la valutazione del regolatore e l’eventuale adattamento dell’autorizzazione. L’obiettivo di questi nuovi percorsi è valorizzare al massimo l'impatto positivo dei nuovi farmaci sulla salute pubblica, bilanciando l’accesso tempestivo con la necessità di monitorare costantemente le evidenze sui benefici e sui rischi connessi.
3) Gene therapy: Editorial control
4) Scoperto nel 1987 come difesa immunitaria utilizzata dai batteri contro l'invasione dei virus, il suo potenziale di modifica è stato realizzato solo nel 2012-2013, quando alcuni scienziati hanno rivelato che può essere combinato con una proteina chiamato Cas9 ed utilizzato per modificare il genoma umano

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